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重组酶聚合酶扩增(RPA)是什么?
重组酶聚合酶扩增(RPA),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物 (Piepenburg等,2006)。
RPA不但可以快速扩增,还支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过,多重化的引物组合需要精心设计,以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是,RPA反应的引物总量(nmol)不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物,就应该控制不同引物的量。另外,检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光物质的兼容性都需要提前考虑。RPA还可以对模板进行定量。因为扩增产物达到可检出水平的时间,是依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多,扩增产物就越快达到可检出水平。不过,这种定量需要精心的实验安排,确保对照反应是同时开始的。举例来说,可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系,RPA反应就会开始。此外,较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。目前大多数RPA相关产品还是由英国的Twist Dx开发的。
重组酶/引物复合物寻找模板DNA的同源序列(红色/蓝色)。链交换后,置换的链由gp32(绿色)结合,引物通过Bst聚合酶(蓝色)延伸。两个引物结合/延伸会产生一个完整的扩增拷贝。重复该过程导DNA指数扩增。(Piepenburg等,2006)